|
|
Selektivní izolace bakterií rodu Bifidobacterium z potravin
Mizerovská, Lucie ; Šárka, Havlíková (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Probiotické bakterie mléčného kvašení (BMK) jsou ve velké míře využívány v potravinářském průmyslu například při výrobě mléčných výrobků, sýrů a fermentovaných salámů, dále se využívají ke konzervaci zeleniny. V diplomové práci byly testovány synbiotické doplňky stravy od různých výrobců. Byla provedena izolace celkové DNA z hrubých lyzátů buněk pomocí magnetických nosičů P(HEMA-co-GMA) ze šesti doplňků stravy. Ze všech výrobků byla izolována DNA v kvalitě pro polymerázovozu řetězovou reakci (PCR). V souladu s údaji deklarovanými výrobcem byla pomocí PCR prokázána přítomnost bakterií rodu Bifidobacterium. Dále byla provedena imunomagnetická separace buněk rodu Bifidobacterium ze dvou výrobků a jejich identifikace pomocí PCR. U obou výrobků byla prokázána přítomnost bakterií rodu Bifidobacterium.
|
|
|
Využití magnetických nano- a mikro částic při izolaci DNA z vybraných druhů potravin
Ráčková, Lucie ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
V práci byla ověřována mikrometoda izolace rostlinné DNA z vybraných druhů zeleniny (cibule, brokolice) a potravinových výrobků v kvalitě vhodné pro konvenční polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Mikrometoda umožňuje izolaci DNA pomocí magnetických nosičů z hrubých lyzátů buněk, získaných přímou homogenizací rostlinných tkání. Byly porovnávány různé způsoby zpracování homogenátů. Homogenizace probíhala v lyzačním pufru s obsahem cetyltrimetylamoniumbromidu (CTAB). Byl testován vliv organických extrakčních činidel chloroform-oktanolu a isopropanolu. Z homogenátů byla DNA purifikována reverzibilní adsorpcí na magnetické částice. Byly testovány celkem čtyři různé typy magnetických částic. U izolovaných DNA bylo provedeno spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty. Amplifikovatelnost DNA byla ověřena pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Byly použity dvě sady specifických primerů pro rostlinnou ribosomální DNA (rDNA). Produkty PCR dlouhé 700 a 220 bp byly detegovány agarózovou gelovou elektroforézou. Byly prokázány rozdíly ve výtěžku a kvalitě DNA v závislosti na způsobu zpracování homogenátů a použitých magnetických nosičích. Navržený postup s dvěma nosiči byl testován pro izolaci DNA z potravinových výrobků obsahujících rostlinný materiál (rostlinné pomazánky). DNA se amplifikovala v PCR. Mikrometoda je vhodná pro DNA analýzu potravin.
|
|
|
Mikroextrakce DNA z rostlinných tkání zeleniny
Cesnak, Filip ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Diplomová práca bola zameraná na porovnanie dvoch mikroizolačných metód DNA s využitím magnetických častíc z potravín rastlinného pôvodu. Vzorky mali rôznorodé, komplexné matrice a boli v surovom (brokolica, list z jahodníka obecného) alebo technologicky opracovanom stave (jahodový džem). Prvá metóda využíva na manipuláciu magnetických častíc magnetický separátor a slúžila ako štandart pri porovnaní. Druhá metóda využíva paramagnetickú ihlu, ktorej výhodou by mala byť možnosť izolácie DNA vo vyššej kvalite bez výraznej kontaminácie polyfenolickými látkami či proteínmi. Vhodnosť metódy bola vyhodnotená štatistickým porovnaním výsledkov získaných obidvomi metódami. Kvalita DNA bola posúdená testovaním amplifikovatelnosti izolovanej DNA pomocou PCR. Amplifikované produkty boli vizualizované na agarózovom gély pomocou elektroforézy.
|
|
|
Selektivní izolace bakterií rodu Lactobacillus z potravin
Novotná, Eva ; Šárka, Havlíková (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Probiotické druhy bakterií mléčného kvašení rodu Lactobacillus hrají důležitou roli v trávicím traktu člověka. Používají se v potravinářském průmyslu a jsou rovněž součástí stravy. K identifikaci baktérií mléčného kvašení rodu Lactobacillus lze použít polymerázovou řetězovou reakci (PCR). V experimentální části práce byla izolována DNA z hrubých lyzátů buněk 4 synbiotických doplňků stravy pomocí magnetických částic P(HEMA-co-GMA). Izolovaná DNA byla amplifikována v PCR pomocí rodově a druhově specifických primerů. V další části práce byly testovány magnetické nosiče s imobilizovanou protilátkou proti bakteriím rodu Lactobacillus. Uvedené částice byly použity k izolaci cílových buněk z výrobků následně identifikovaných pomocí rodově specifické PCR.
|
|
|
Identifikace bakterií druhu Lactobacillus acidophilus v probiotických výrobcích
Sznapková, Veronika ; Trachtová, Štěpánka (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Probiotické bakterie mléčného kvašení (BMK) jsou významnou součastí především fermentovaných mléčných výrobků, farmaceutických preparátů a doplňků stravy. V současné době se k rychlé a přesné identifikaci bakterií využívají molekulárně biologické metody založené na amplifikaci DNA. Cílem diplomové práce bylo nekultivačními postupy identifikovat bakterie rodu Lactobacillus a druhu Lactobacillus acidophilus v komplexních matricích celkem sedmi různých doplňků stravy. Celková DNA byla izolována z hrubých lyzátů buněk ve výrobcích s využitím magnetického nosiče P(HEMA-co-GMA). Amplifikovatelnost DNA byla ověřena v PCR s primery specifickými pro doménu Bacteria. Izolovaná DNA byla dále amplifikována s použitím primerů specifických pro rod Lactobacillus a druh Lactobacillus acidophilus s cílem prokázat přítomnost tohoto bakteriálního rodu a druhu, jež jsou deklarovány výrobci. Výsledky identifikace bakterií získané pomocí PCR byly porovnány s údaji deklarovanými výrobci.
|
|
|
Magnetické částice a jejich využití v biotechnologii
Knápková, Monika ; Konečná, Jana (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Práce je zaměřena na magnetické částice, které jsou využívány v řadě biotechnologických aplikací. Teoretická část práce pojednává o specifických vlastnostech těchto částic, o materiálech, kterými mohou být tvořeny a dále jsou zmíněny některé biotechnologické aplikace využívající magnetické částice. V experimentální části byly využity vybrané druhy magnetických částic za účelem izolace nukleových kyselin. Kvalita izolované DNA s ohledem na čistotu byla vyhodnocena za použití metody polymerázové řetězové reakce a jejích modifikací. Dále byla využita vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM analýza) za účelem ověření kvality izolované DNA a pro rozlišení bakterií Lactobacillus casei a Lactobacillus rhamnosus. Izolace DNA pomocí magnetických nosičů byla úspěšná, přičemž z hlediska koncentrace byly nejvhodnější komerčně dostupné mikronosiče MPG a magnetické mikročástice typu Fkol 77ox. Z hlediska čistoty byly pro izolaci DNA nejlepší magnetické nanočástice F79/L3 PLL. Bakteriální druhy Lactobacillus casei a Lactobacillus rhamnosus se pomocí HRM analýzy nepodařilo rozlišit.
|
|
|
PROBIOTICKÉ GENY POTRAVINÁŘSKY VÝZNAMNÝCH BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ
Konečná, Jana ; Ševčovičová,, Andrea (oponent) ; Doškař, Jiří (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou různých typů magnetických částic pro extrakci DNA na pevné fázi. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Eluční podmínky DNA byly také optimalizovány. Poté byla testována bakteriální DNA a metoda použita k izolaci z reálných vzorku potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, použivána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Byly zjištěny rozdíly mezi použitými metodami extrakce z křivek tání HRM – PCR analýz.
|
|
|
PCR identifikace nepatogenních bakterií izolovaných ze sýrů
Jurečková, Nela ; Doušková, Dagmar (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Různé druhy rodu Bifidobacterium jsou součástí běžné střevní flóry lidí i zvířat. Jsou známé pro svůj prospěšný vliv na zdraví a proto je lze využít v potravinách a farmaceutických produktech jako probiotika. Mimo jogurty a fermentovaná mléka lze nyní využít i sýr jako potravinový nosič probiotických bakterií. Tato diplomová práce byla zaměřena na optimalizaci izolace bakterií rodu Bifidobacterium. K izolaci DNA byly použity magnetického částice (P(HEMA-co¬-GMA)) v přítomnosti 8% polyethylenglykolu PEG 6000 a 5 M chloridu sodného a metoda fenolové extrakce s následným přesrážením ethanolem. Izolovaná DNA pak byla použita v doménově, rodově i druhově specifických PCR. Metoda optimalizovaná pro průkaz bakterií rodu Bifidobacterium v tvrdých sýrech byla testována na experimentálně připravených probiotických sýrech, které obsahovaly potenciální probiotické bakterie ze sbírky Laktoflóra. Tyto bakterie byly zařazeny do druhu pomocí PCR s druhově specifickými primery. Ve všech vzorcích probiotických sýrů byla prokázána přítomnost bakterií druhu Bifidobacterium animalis.
|
|
|
Příprava vzorků pro analýzu DNA v potravinách rostlinného původu
Silná, Renata ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Izolace vysoce kvalitní rostlinné DNA je nezbytná pro mnoho aplikací molekulární biologie. Nicméně, rostlinná DNA a potraviny rostlinného původu obsahují velké množství polysacharidů, polyfenolů a jiných sekundárních metabolitů, které snižují výtěžnost a kvalitu izolované DNA. Cílem této diplomové práce byla příprava vzorků a různých potravinových matric pro izolaci DNA magnetickými částicemi. Jednalo se o 5 druhů zeleniny a 10 druhů různě zpracovaných zeleninových potravinových výrobků. Homogenizace matric byla provedena v CTAB pufru. Izolace rostlinné DNA byla provedena magnetickými částicemi s navázanými karboxylovými skupinami. Veškerá DNA byla izolována v kvalitě vhodné pro konvenční PCR, testována dvěma sadami primerů umožňujících amplifikaci 700 bp amplikonů, u tepelně zpracovaných výrobků na 220 bp a pro PCR v reálném čase. Byla srovnána účinnost separace magnetických částic s navázanou DNA pomocí magnetického separátoru a magnetické jehly. DNA vyšší čistoty byla izolována magnetickou jehlou. Mikrometoda izolace rostlinné DNA z homogenátů s CTAB pomocí magnetických částic je vhodná pro různě zpracované potraviny.
|
|
|
Využití magnetických částic při izolaci DNA z vybraných probiotických výrobků pro děti
Vozárová, Petra ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
V potravinárskom priemysle je dôležité správne identifikovať druhy baktérií a ich vlastnosti, aby mohli byť použité ako probiotikum v doplnkoch stravy. Na to sa využívajú metódy DNA diagnostiky. V experimentálnej časti práce bola izolovaná DNA zo štyroch probiotických doplnkov stravy pre deti. Na izoláciu boli testované magnetické častice P(HEMA-co-GMA). Izolovaná DNA bola amplifikovaná pomocou PCR a bola preukázaná prítomnosť DNA rodov Lactobacillus, Bifidobacterium a Bacillus v súlade s údajmi deklarovanými výrobcom. Pomocou amplifikácie DNA metódou PCR s využitím druhovo špecifických primerov bola preukázaná prítomnosť druhov L.acidophilus a B.animalis v súlade s údajmi na výrobku. Pomocou PCR za daných experimentálnych podmienok nebola preukázaná prítomnosť druhu L.casei v jednom výrobku.
|
host ::
RSS.